豬雄烯酮（ADT）ELISA試劑盒-競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗豬雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入豬雄烯酮（ADT）校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入HRP標(biāo)記的豬雄烯酮（ADT）抗原（酶標(biāo)抗原），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中豬雄烯酮（ADT）的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中豬雄烯酮（ADT）的濃度。

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用。

3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測(cè)定。

6、 待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)前，請(qǐng)排出該因素。

7、 通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、 合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、 使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟，可以提高檢測(cè)精度。

5、 底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。

7、 實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過(guò)期試劑盒。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：12、6、3、1.5、0.75、0 nmol/L.

操作程序

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

1、 按前面說(shuō)明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測(cè)樣本50μL。

3、除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL。

1、 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

2、 揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

3、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

4、 所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結(jié)果計(jì)算

1、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋，通過(guò)上述方法測(cè)的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

試劑盒性能指標(biāo)

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

4、靈敏度

檢出劑量小于0.1 nmol/L。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評(píng)估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組豬雄烯酮（ADT），與結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉。

7、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月。

5、 檢測(cè)范圍

0.375 nmol/L - 12 nmol/L